子計畫基本資料(2)

 (三) 子計畫：5、西太平洋珊瑚共生梯形蟹類之地理親緣研究     新台幣：仟元

五、計畫中文摘要：

六、計畫英文摘要：

七、計畫內容：

（一）研究目標與重點：

梯形蟹類在分類地位是屬於節肢動物門（Arthropoda）甲殼綱（Crustacea）十足目（Decapoda）扇蟹總科（Xanthoidea）之下的梯形蟹科（Trapeziidae）（Guinot, 1978）。目前全世界已知的扇蟹類約有200屬800種之多，是所有螃蟹中種類最多的類群，其中百分之八十以上的種類分佈於熱帶印度－太平洋。梯形蟹類原本只屬廣義扇蟹科裡的亞科，被提昇為科之後，梯形蟹科可分為兩亞科，即為梯形蟹亞科（Trapeziinae）和圓頂蟹亞科（Domeciinae）。在台灣已知與分枝狀造礁珊瑚共棲的扇蟹共有13屬30種，其中有8屬23種是以珊瑚為專一宿主；全部的梯蟹科種類有3屬12種皆屬之，且與宿主珊瑚有共生的行為關係（何，1994; Jeng, 1999）。

梯形蟹類在全世界已知4屬42種（Castro, 1997），其中陳氏梯形蟹（Trapezia cheni）和葛氏梯形蟹（T. garthi）的模式標本在台灣被發現和命名（Galil, 1983）。梯形蟹類外部形態特徵十分明顯，且體色鮮明，主要分布在珊瑚礁海域，在低潮線下至50公尺以淺的水層，與分枝狀造礁珊瑚有著密切的共生關係，因此在SCUBA diving（水肺潛水）進行調查研究盛行之後也倍受青睞，其中國外學者有頗多研究成果（Crane, 1947; Guinot, 1964; Patton, 1966, 1974, 1994; Garth, 1964, 1974, 1989; Knudsen, 1967; Castro, 1976, 1978, 1988, 1997; Haig, 1976; Coles, 1982; Abele & Patton, 1976; Galil, 1985, 1986, 1988; Galil & Lewinsohn, 1984, 1985; Galil & Vanmini, 1990）。這些學者調查的研究結果指出，與分枝狀造礁珊瑚共棲的蟹類大多以軸孔珊瑚科（Acroporidae）及鹿角珊瑚科（Pocilloporidae）的珊瑚種類為共棲對象；這兩科的珊瑚在台灣海域屬於常見（戴，1989），因此國內有關珊瑚共棲性甲殼類之研究，也都以這兩科的某些種為研究對象（陳，1983; Chang et al., 1987; 張及鄭，1990; 游等，1996; 鄭等，1997; Jeng, 1994a, b, 1998, 1999）。

與珊瑚共棲的扇蟹類之個體皆偏小，頭胸甲扁平，步足指節具雙爪，前節末緣與指節間具特化關節，能使指節彎曲卡住，以便牢牢抓住珊瑚表面。這一類以珊瑚為宿主的扇蟹，可以分成專一性共棲（Obligate symbionts）與非專一性共棲（facultative symbionts）（Patton, 1996; Grath, 1964, 1974; Kundsen, 1967; Castro, 1976, 1988）。梯形蟹類均屬於前者，成蟹皆終生棲息於珊瑚枝叢裡，且以宿主珊瑚分泌粘液和其中粘著的細菌、有機踤屑或濾食周圍水中的浮游生物為食（Patton, 1966）。過去以為共棲蟹類由宿主珊瑚取得庇護所與食物來源，而認為牠們是寄生種類；Glynn (1983)在共演化（coevolution）方面，指出梯形蟹與珊瑚槍蝦（Alpheus lottini）會在棘冠海星吃食珊瑚群體時，跑到群體頂端以第一對鉗腳攻擊折斷棘冠海星的棘刺，直到海星離開；這項發現被証實後，寄生的觀念被修正為互利共生。本人在研究尖枝列孔珊瑚（Seriatopora hystrix）的白化和健康群體內十足類群聚組成時，發現三種梯形蟹Trapezia lutea, T. guttata和T. areolata在數量上佔前1、2、5名；這三種佔總個體數量為28.4％。但是在10個白化珊瑚群體內，則沒有發現任何梯形蟹個體（Jeng, 1999），顯示出梯形蟹與活的尖枝列孔珊瑚有著極密切的共生關係存在，同時也意味著活珊瑚群體提供食物來源。

這些與珊瑚共棲的梯形蟹種類之分布，常與宿主珊瑚的分布一致，尤其是專一性共棲種類，不論是水平分布或水深分布，與宿主珊瑚真是密不可分。其中梯形蟹屬（Trapezia）的宿主珊瑚甚至只限於鹿角珊瑚；而擬梯形蟹屬（Tetralia）也非軸孔珊瑚科的珊瑚莫棲的地步（Knudson, 1967; Garth, 1974; Castro, 1988），可見共棲性梯形蟹對珊瑚依賴程度之深，更提供深入追究與這些分枝狀石珊瑚共演化的証據。

梯形蟹科全部屬種皆為專一性共棲種類（Galil and Vannimi, 1990），其中梯形蟹屬或擬梯形蟹屬的種類只有一些共同的特性，即(1)雌雄配對率高，且同一塊珊瑚群體中成蟹通常只有雌雄一對，顯示其中有強烈的種內或種間競爭。(2) 雌雄配對個體間體型差異不大，一般雌性甲寬略大於雄性甲寬。(3) 雌蟹抱卵率高，且終年可抱卵（Patton, 1966; Preston, 1973; 陳，1983）。這些特性，有別於其他科蟹類的生態習性，這些特殊的生態習性或行為，有時亦可作為同屬間在形態之外的區別特徵，甚至科級地位亦然。目前在梯形蟹科的外部形態演化及生物地理親緣方面尚未有人探討。

Serène (1972)估計在印度西太洋已知2千種蟹類中，有超過5百種棲息在活珊瑚或死珊瑚礁裡。有趣的是梯形蟹類喜歡與分枝狀石珊瑚共棲，且相互依賴形成共演化（coevolution）關係，但是梯形蟹類如此明顯可從扇蟹類區分出來，而且演變出與宿主珊瑚如此強烈的互利共生，是非常值得深入探究的課題。這些分枝狀石珊瑚在台灣均是常見種，同時在西太洋地區到處可見，因此加強這方面的調查研究，將有機會發現梯形蟹和分枝狀石珊瑚的生物地理親緣關係。

目前在以分子遺傳標誌探討珊瑚共棲甲殼類種化及地理親緣的研究方面，則以槍蝦（Alpheus spp.）的資料最為詳細（Knowlton et al., 1993; Knowlton & Weigt, 1998）。Knowlton et al. (1993) 以蛋白質電泳、粒線體DNA（mtDNA）序列和行為差異研究七對跨巴拿馬地峽的槍蝦種對（species pairs），由Nei遺傳距離和mtDNA序列變異的程度顯示，至少有一對的種對其分歧應該是在巴拿馬地峽關閉之就已種化，而不是所有的種對的分化都是受到巴拿馬地峽在三百五十萬年前關閉的地質事件影響。而這一推論在隨後擴大研究十五對種對的研究受到確認（Knowlton and Weigt, 1998）。因此，雖然在外型極為相似的種對，其分歧的時間可能有相當大的差異。

 

（二）研究方法及進行步驟：

(1) 研究方法

地理親緣學（Phylogeography）的研究是以分析基因樹（gene genealogies）的親緣關係所呈現出不同族群間的相依性，再以這樣的相依性探討時間（例如，地質事件）與空間（族群變動）因素影響物種演化的可能機制（reviewed in Avise, 1994）。同時進行不同物種的地理親緣探討後，找出不同物種的基因樹所呈現出的公同性（concordance），便可理清在整個地理區的生物演化特徵。

分子遺傳標誌的特性

a. 粒腺體DNA標誌：

粒腺體DNA標誌已是被廣泛的運用在族群遺傳和地理親緣關係研究上，而且粒腺體DNA標誌具有許多特性，如母系遺傳、不具重組現象等皆是應用在這方面研究的條件之一（reviewed in Avise, 1994）。其中以粒線體細胞氧化酵素I 基因(mitocondrial cytochrome oxidase I, mtCOI)序列最被使用於甲殼類的研究（例如，Knowlton et al., 1993），本研究將也利用此一基因進行探討梯形蟹地理親緣的遺傳標誌之一。

b. 核介入子（nuclear intron）序列：

基因的序列在基因庫中通常分為表現子（exon）和介入子。表現子最後會被轉譯為蛋白質，而介入子只被轉錄但不轉譯。通常介入子的演化速度較快，而且是趨向中性的序列，常用來探討種內或近緣種的親緣關係研究（reviewed in Palumbi, 1996）。而且由於在介入子兩端的表現子相當保守，因此，可以設計通用引子（universal primers）應用於不同物種的研究，Duda and Palumbi (1999)以Elogation Factor Alpha –1的介入子序列研究草蝦的族群遺傳，發現在西太平洋與印度洋區的地理族群間具有顯著的分歧。

 

(2) 進行步驟

本計畫擬以三年為一期，預計進行兩期六年。第一期先以台灣地理親緣研究為主軸，並以位在南中國海的東沙島和南沙島為前進南中國海和印尼－馬來島弧採樣與找出可能的地理親緣形式。因此，採樣的地點包括本島（北部、南部、東部）及各離島（澎湖群島、綠島、蘭嶼、小琉球、東沙島和南沙太平島）。第一年：前往台灣本島及各離島（綠島、蘭嶼、小琉球和澎湖群島）和國外菲律賓、琉球、馬來西亞（東西馬婆羅洲）等地潛水調查。開始針對研究物種進行野外採樣，實驗室著手進行介入子DNA標誌之PCR增幅與定序的工作。第二年：東沙島和南沙太平島、大陸海南島、印尼和澳洲等地進行採樣，其中前往東沙島和太平島採樣方式，將與行政院海岸巡防署合作。在幾分子遺傳標誌來探究梯形蟹地理親緣關系上，並延續第一年介入子DNA標誌定序工作，同時著手微衛星library的建立，搜尋及測試。著手策劃國外採集的計畫與時間表。第三年：完成微衛星基因座多型性的資料，進行台灣地理親緣研究資料分析，撰寫研究報告，前往泰國、關島、帛琉、新加坡、越南進行跨國採樣。第四年／第五年：前往馬來西亞、巴布亞紐幾內亞和所羅門群島等進行跨國採樣，並開始粒線體DNA或介入子標誌定序及微衛星基因座多型性分析。第六年：綜合分析所有的序列與微衛星資料，檢驗Rosen (1988)所提出的三個假說。

國內外潛水採樣地點均以珊瑚礁海域為主，然而台灣海域的珊瑚礁群聚依不同的珊瑚組成分成典型熱帶珊瑚瑚礁（台灣南部、小琉球、綠島、蘭島、台灣東部）和非珊瑚礁群聚（澎湖、台灣北部和東北角）。而東沙與南沙太平島為典型的熱帶環礁與堡礁。前往國外及大陸海南島等地區採樣，將與國內潛水團體配合出團，一來潛水裝備運送方便，其次採樣照相及標本攜帶比較有保障，同時也可降低差旅費支出。所採獲之梯形蟹必須在70％酒精固定前，先拍好標本照，以利將來體色比對。在採樣技術上儘可能不傷及珊瑚群體。

 

分子生物技術與統計分析

分子遺傳標誌的發展與實際操作將由本所助研究員陳昭倫博士實驗室協助。陳博士以分子遺傳標誌探討海洋無脊椎動物的種化與親緣關係具有豐富的經驗，本次院整合計劃亦有參與。

（1）粒線體與介入子序列分析

粒線體和介入子的引子設計參考Palumbi (1996b)，先期利用Elongation factor1、Actin Intron 2、和Camodulin intron 3等通用引子可是用於不同的物種。將在測試其多型性後，選取兩組用於本研究中。

（2）分子遺傳及族群遺傳等統計分析

介入子序列以Clustal W 1.7 (Higgins et al., 1997)排序﹐再加以人工的修正。由對偶基因所計算出的遺傳距離以PHYLIP 3.5c(Felsenstein, 1993)和PAUP 3.0 (Swofford, 1993)建構對偶基因的基因系統樹(gene genealogy)。以Arlequin 2.0 (Schneider et al., 1997) 分析分子遺傳及族群遺傳的各項統計介量。 以卡方測驗(X²-test)測試各基因座偏離哈溫定律的顯著性： 第一, 除了最共同的對偶基因(most common alleles)之外, 所有的對偶基因合併以二對偶基因(two-allele)卡方測驗分析(Swfford and Selander, 1989);第二將所有的同合子(homozygotes)和異合子(heterozygotes)各自合併﹐再以二階卡方測驗(two-class)分析(Lessios, 1992)。遺傳距離(Genetic distances)計算以Nei’s D values(以allele frequency為主)作比較。

 

（三）預期完成之工作項目及具體成果：

1. 完成台灣及西太平洋海域梯形蟹類的地理親緣結構。

2. 釐清在小尺度的範圍之內海流對梯形蟹類親緣地理結構影響的假說。

3. 以東南亞區域梯形蟹類的親緣地理結構測試Rosen (1988)三個假說。

4. 完成分析梯形蟹類和分枝狀石珊瑚的共演化關係與機制。

 

（四）可能遭遇的困難與解決的方法：

遺傳標誌的多型性可能會偏低。由於對於珊瑚共生梯形蟹類的基因組尚未有人了解，找到可使用的多型性遺傳標誌可能不多。解決的辦法是多方測試不同的標誌，如介入子和微衛星，以找出更多的可適用的遺傳標誌。

 

（五）國際合作：

　本人從事台灣甲殼類系統分類多年，對於與珊瑚共生梯形蟹類的分布與生態應有掌握，因此對於台灣及離島樣本的採集應無問題。同時，本人與新加坡大學生物系Dr. Peter Ng有長期的合作關係，Dr. Ng為國際甲殼類系統分類的權威，同時對於南亞各國的甲殼類有深入的研究。在與Dr. Ng通訊之後，他應允協助本人安排野外工作及採集南亞各國的梯形蟹標本。

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八、主持人、共同主持人、協同研究人員近三年內曾參與之專題研究計畫

（第三年）